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2020-01-01
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品牌：基華
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促銷(xiāo)價(jià)：
產(chǎn)品說(shuō)明
GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA[敏感詞]植物基因組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質(zhì)粒含有篩選標簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作。
基因型
C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR) Nopaline
操作方法
1. 取-80℃保存的農桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時(shí)[敏感詞]冰中。
2.每100 μl感受態(tài)加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（轉化效率較高，[敏感詞]次使用前[敏感詞]做預實(shí)驗確定所加質(zhì)粒的量），用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。
3. 加入700 μl無(wú)抗生素的LB或YEB液體培養基，于28℃振蕩培養2~3小時(shí)。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天
注：當平板只含有50 μg/ml kan 時(shí)，28℃培養48 h即可；平板中同時(shí)加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時(shí)，需28℃培養60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養72-90 h。
注意事項
1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉化效率下降一個(gè)數量級。
2. 混入質(zhì)粒時(shí)應輕柔操作。轉化高濃度的質(zhì)?？上鄳獪p少終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養不足，陽(yáng)性克隆生長(cháng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質(zhì)粒用量。
4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml，過(guò)高的利福平濃度不利于農桿菌生長(cháng)，會(huì )降低其生長(cháng)速度和轉化效率。本公司感受態(tài)計算轉化效率時(shí)所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。
5. 培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(cháng)、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時(shí)不考慮這些抗生素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低
